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荧光显微镜的滤色系统详解

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滤色系统是荧光显微镜的重要部位,由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号,各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名,前面字母代表色调,后面字母代表玻璃,数字代表型号特点。如德国产品(Schott)BG12,就是种蓝色玻璃,B是蓝色的第一个字母,G是玻璃的第一个字母;我国产品的名称已统一用拼音字母表示,如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24,Q是青色(蓝色)拼音的第一个字母,B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名,如K530,就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名。

1.激发滤板

根据光源和荧光色素的特点,可选用以下三类激发滤板,提供一定波长范围的激发光。

紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5,外加一块BG-38,以除去红色尾波。

紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300~450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3,外加BG-38。

紫蓝光激发滤板:它可使350~490nm的光通过。常用型号为QB24(BG12)。

最大吸收峰在500nm以上者的荧光素(如罗达明色素)可用蓝绿滤板(如B-7)激发。

近年开始采用金属膜干涉滤板,由于针对性强,波长适当,因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板,均远比玻璃滤板效果好。

激发滤板分薄厚两种,一般暗视野选用薄滤板,亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。

2.压制滤板

压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过,提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应,常用以下3种压制滤板:

紫外光压制滤板:可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6 K460。

紫蓝光压制滤板:能通过510nm以上滤长的荧光(绿到红),能与BG-12组合。通常用OG-4 K510或OG-1 K530。

紫外紫光压制滤板:能通过460nm以上波长的荧光(蓝到红),可与BG-3组合,常用OG-11 K470AK 490,K510。

(三)反光镜

反光镜的反光层一般是镀铝的,因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少,反射达90%以上,而银的反射只有70%;一般使用平面反光镜。

(四)聚光镜

专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。

1.明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器,它具有聚光力强,使用方便,特别适于低、中倍放大的标本观察。

2.暗视野聚光器

暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜,因而除散射光外,激发光也不进入目镜,可以使用薄的激发滤板,增强激发光的强度,压制滤板也可以很薄,因紫外光激发时,可用无色滤板(不透过紫外)而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度,提高了图像的质量,观察舒适,可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。

3.相差荧光聚光器

相差聚光器与相差物镜配合使用,可同时进行相差和荧光联合观察,既能看到荧光图像,又能看到相差图像,有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。

(五)物镜

各种物镜均可应用,但最好用消色差的物镜,因其自体荧光极微且透光性能(波长范围)适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比,而与其放大倍数成反比,所以为了提高荧光图像的亮度,应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本,应使用镜口率大的物镜,配合以尽可能低的目镜(4×,5×,6.3×等)。


(六)目镜

在荧光显微镜中多用低倍目镜,如5×和6.3×。过去多用单筒目镜,因为其亮度比双筒目镜高一倍以上,但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜,观察很方便。

(七)落射光装置

新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后,波长短的部分(紫外和紫蓝)由于滤镜上镀膜的性质而反射,当滤镜对向光源呈45。倾斜时,则垂直射向物镜,经物镜射向标本,使标本受到激发,这时物镜直接起聚光器的作用。同时,滤长长的部分(绿、黄、红等),对滤镜是可透的,因此,不向物镜方向反射,滤镜起了激发滤板作用,由于标本的荧光处在可见光长波区,可透过滤镜而到达目镜观察,荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高,在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外,更适用于不透明及半透明标本,如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置,称之为落射荧光显微镜。
 

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